如何实现光学超分辨（下）

簡體傳統

席鹏着

第六章 PALM/fPALM 你掌心的痣我总记得在哪里

其实自从上次写完STORM，对于采用“开关-定位”这一族超分辨技术来说，已经没有什么更新鲜的技术可写了。但是这里有两个几乎在同一时间被发明的孪生兄弟，却不得不提。先把两篇文章的信息放上：

Eric Betzig, George H. Patterson, Rachid Sougrat, O. Wolf Lindwasser, Scott Olenych, Juan S. Bonifacino, Michael W. Davidson, Jennifer Lippincott-Schwartz, Harald F. Hess, “Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution”, Science 2006 Vol. 313 no. 5793 pp. 1642-1645 (Received for publication 13 March 2006. Accepted for publication 2 August 2006. Published Online August 10 2006)

Samuel T. Hess, T. P. K. Girirajan, and M. D. Mason, “Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy,” Biophysical Journal, vol. 91, no. 11, pp. 4258-4272, 2006. Submitted June 12, 2006, and accepted for publication August 28, 2006. Published 1 December 2006

很多事件都非常相似，但是没有这么相似：这两个技术，第一个叫PALM，第二个叫FPALM；发明人中，第二个发明人叫Hess，第一个的发明人之一、共同第一作者也叫Hess（如果把s掰直成l，那就是STED的发明人教主Hell，更乱了）；第一个投出时间在06年3月早春，第二个是在06年夏天6月。


Eric Betzig	Harald Hess	Samuel Hess

先说Eric Betzig，我是很有幸读到他的那篇2006年的Science论文，发现他竟然和我同在美国密西根州兰欣市。然后在组会上给大家介绍他的工作，我老板也很惊讶：“哦，是他啊？原来做近场光学的，早几年我们还一起吃过饭、讨论过关于光学成像的相关问题。后来他自己出去开公司了，就没了联系。没想到他竟然去了HHMI。”

于是我就很得意地畅想，或许，我们曾经在同一条河里钓过bash，只不过不在同一个时空而已。甚至，有可能从他钩下逃脱的小鱼，刚好在另一个时域被我捞起。兰欣能钓鱼的地方并不多。

Eric Betzig，一个典型的高帅富的奋斗故事。以下故事部分来源于HHMI的个人介绍，和2008年Nature Photonics的编辑采访：

Eric本科毕业于Caltech，在康奈尔大学获得博士学位。之后进入贝尔实验室，在那里的六年中，他研究近场光学（上篇帖子里有读者希望我再写一点perfect lens的超分辨，其中就有很多是近场光学倏逝波的探测）并将其用于生物细胞成像。他注册了一家公司叫New Millennium Research，但是很快就得到父亲的召唤，去管理他们的加工业帝国。要知道，在汽车工业兴盛的密西根州，加工业的地位举足轻重。

在那里，有一个困扰着加工业多年的问题，也许因为它太难，所以大家对它习以为常，熟视无睹：为了加工一个小部件，必须让一个很大很重的部件移动或停止。这样，很多的时间和能量消耗在了移动加工工具上。Eric巧妙地让加工机械高速移动，却不牺牲加工精度。因此极大地提升了加工效率。

但是，燕雀安知鸿皓之志。在无数个深夜，Eric在梦里都回到了他熟悉的显微镜前，那里，一个个细胞在游动，神秘的生命信号在传递。然而，模糊的双眼无法看清这一切。。。他惊醒了！因为他想到了应该怎么做就能看到这一切的神奇。

然而Eric也是一个十分现实的人：在申请职位的时候，他的简历上，有十年之久是学术空白。“要想让这个世界再听你的理论，你必须拿出一些让人折服的好东西。”Eric说。

可是，他老爹似乎并不是非常支持儿子离开家族企业。Eric在到HHMI之前，没有自己的实验室。其实要想留住儿子，划出30平米的小房子做个实验室，应该不是难事。

Eric他们所有的实验都因陋就简，大部分是在他的好朋友，Harold Hess在加州的的公寓改装的实验室完成的。在那里，他们把光学平台放在客厅里，鼓捣他们的新型显微系统。可能我们读者里面，很多人的实验室硬件条件比他们更好。

Hess承认，自己与Betzig对生物学的认识都不深。但是他们坚信，生物学的发展能够为超分辨带来转机。于是，他们屡败屡战了15年，希望能运用生物学知识获取高分辨率的显微图像。当Hess和Betzig了解到Lippincott-Schwartz和George Patterson在2002年发明的光敏绿色荧光蛋白（photoactivatable green fluorescent protein）后，他们知道他们已经找到了解决问题的关键所在：开关-定位。

接下来的整个冬天，Eric Betzig、Harald Hess以及Lippincott-Schwartz等人都一直在那间狭小的没有取暖设备的实验室里工作。

三个人，一个团队。没有漫长的圣诞假期，没有奢侈的实验装备，有的，只是一个共同的信念支持着他们前行：既然理论上可行，那就不要借口。我们一定要在实验上证明它！

冬去春来的时节，他们终于看到了转机。回想起当时的情形，Lippincott-Schwartz指出：“他们当时非常激动。我还记得当我们得到第一张显微图像时，你根本无法看出那是什么东西。直到我看到他们将荧光图像和电镜图像叠加之后的结果才相信，我们成功了。我当时觉得这一切真是太神奇了。”

2006年，Eric Betzig、Harald Hess以及Lippincott-Schwartz小组在《科学》杂志上发表了他们的PALM研究成果。使用PALM可以清楚得看到细胞黏着斑和特定细胞器内的蛋白质。整个出版过程：3月13号投稿，8月2号接收，10号网上发表。

PALM用于观察溶酶体跨膜蛋白。

再来说说FPALM的故事。Samuel T Hess，分别在耶鲁大学和康奈尔大学完成本科和博士学位；当时在Maine大学担任助理教授。在那儿他申请了一个课题，很快要结题了，所以有些经费要赶紧花掉（美帝也有类似制度）。但是Samuel并没有随便买些家当，而是沉迷于和学校的化学工程师和生物学工程师的一些讨论：如何提高观察活体细胞脂筏结构的分辨率？

2005年的一个夏夜，Hess被一阵电子打击乐吵醒。邻居家又在举办舞会了。无奈啊，爱好宴乐的芸芸众生，哪知道我等科研工作者都是不眠不休的怪物呢？半睡半醒的Hess走下楼来，本想出去告诉他们安静些，但是碍于情面（看过《生活大爆炸》的读者大概都知道，我们科学家是多么不擅长这个的），只好作罢。他随手画了一副设计图，可以通过借助荧光标记的蛋白质来显示细胞形态。

所以，我经常教育我的学生：当你思路不清楚的时候，画图！

第二天早上，当Hess重新翻看这幅非清醒状态绘制的潦草的设计图时，不由得大笑起来：它是那么简洁，但解决了“看不清”的难题。不可能吧？再看看，令人吃惊的是，这幅设计图竟然没有未被任何物理原理。于是他将信将疑地把这幅图拿给物理系的同事peer review，也没有发现任何问题。

接下来，Hess就按照他的设计图开始制作显微镜了。此时，他的科研经费所剩不多，而结题时间转眼就到。因此，Hess等人以最快的速度组装好显微镜，并进行了试验。同时，在不到两天的时间里，缅因州立大学表面科学技术实验室的同事就为Hess制备好供检验显微镜效果的蓝宝石晶体样品。所以，有一个高效的合作团队至关重要。

相比与Eric等人的效率，Samuel还是相对有点慢了：从2005年有了想法、做了实验到2006年6月文章投出，他用了一年时间。这个几乎直接导致了他的工作的影响因子比Eric他们差了一个数量级。同时，由于他作图相对潦草——未能在生物细胞上演示这一工具的强大魅力，也直接导致了他的工作相对不大受到关注。

2006年底，《生物物理学期刊》（Biophysical Journal）刊登了Hess小组的科研成果。2007年，Hess小组证明了FPALM可以分辨细胞膜脂筏上的蛋白质簇。

回到我们本章的标题。PALM/FPALM，突然想起了林忆莲的《至少还有你》：

如果全世界我也可以忘记

至少还有你

值得我去珍惜

你掌心的痣

我总记得在哪里。

在《圣经—新约》里，耶稣第二次来到门徒中间，门徒们认不出已经变了身的救主。于是耶稣将手让门徒看。当门徒们看到那钉痕，立刻就分辨了出来，就欢呼：“是主！”从此，几个没有受过教育的村夫，几个已经吓破胆准备散伙的门徒，重新团结起来，将耶稣的思想传遍了世界，影响着我们今天的主要生活。

PALM，也正是因为在手掌（衍射极限分辨决定的区域内）范围内通过蛋白质开-关的效应，因为只有一个钉痕，所以就能够通过定位将其分辨出来了。

在写完本章的同时，很欣喜地知道，我们的超分辨文章发表在PLoS ONE上。看来科普有好报啊！这一工作是我国首次实验报道STED超分辨，且在三种细胞器和RNA上均验证了STED所带来的分辨率提升。

由于PLoS玩的是paper2.0，也就是论文的影响不再是SCI因子说了算，而是读者您说了算，期待大家注册个账号并给点掌声！我们在那里互动一下吧！你的支持是我继续写下去的动力！

文章链接：

我国STED超分辨工作在PLoS ONE发表
科学网报道：研究实现STED超分辨率光学显微成像

第七章 SSIM 疏影横斜水清浅

2011年的FOM闭幕式上，会议主席Fred Brakenhoff很遗憾地通知大家，Mats Gustafsson教授不幸因癌症逝世，享年51岁。
2012年的FOM的副主题，就是纪念这个伟人和他带给这个世界的SSIM。

什么是SSIM？全名Saturated Structured Illumination Microscopy，饱和结构光照明显微。在介绍SIM之前，可以给大家看一张非常典型的照片：

在椅子背上，你看到了什么？不规则的条纹，对不对？这种条纹，如果你把图片放大，可以看到是由于椅子前后的网状织物叠加而成。在科学上，大家将其称为莫尔条纹。

由于织物的网格比较密不容易被看到（频率高），莫尔条纹则比较粗容易被看到（频率低），因此如果知道B的结构，和A+B所叠加的莫尔条纹，将不能探测的高频转化为能探测的低频，就能够反推出A所携带的精细结构信息。这就是SIM的精义。如下图所示。

回顾另一种能够带来分辨率提升的、广为人知的技术：共聚焦。共聚焦通过一个点照明，加一个针孔实现分辨率提升。准确地说，由于在分辨率这个事情上，邻居总是给我们干扰，所以用一个针孔把邻居的光噪声给它挡上，就能够将分辨率提升。

共聚焦通过阻挡接收实现分辨率提升，而SIM则是通过给照明光一个调制实现分辨率提升。

能提升多少？共聚焦是1.4倍，因为即使针孔小到只有一个点，根据光路可逆原理，这个点到了样品上也有点扩展函数那么大，最终，共聚焦的点扩展函数就是激发光的点扩展乘以针孔点扩展。如果将SIM的结构调制通过共轭放在接收端，则SIM也是一个一维调制。进一步，通过从多个角度进行一维限制，可以最终得到二维的分辨率提升。目前，比较流行的是每隔120度进行一次。SIM可以提升2倍的分辨率。

如果想进一步提升分辨率，则需要更细的线条。而前面我们讲过，用光学一次成像，所能得到的细线的粗细是受衍射极限限制的。解决的方案只有一个，那就是通过某一类的饱和机制，形成更细的线。这样，再加上SIM提升的2倍，就能够实现完全突破衍射极限的限制了。
发张SIM的图片，给大家惊艳一下。

A wide-field microscopy image (left) and a superresolution structured illumination microscopy (SR-SIM) image (right) each shows actin (green) and tubulin (red) cytoskeleton in a primary chicken fibroblast. (http://www.photonics.com/Article.aspx?AID=47750)

写到这里，我想很多人都会对超分辨显微这一领域跃跃欲试了。但是，你可能会觉得，自己没有相关的科研背景。有意思的是，Mats Gustafsson在他开始博士后研究时，并没有正规的光学训练。他之前是从事电子学的。他在接受采访时说：“我的电学背景让我对这个世界有一种独到的认识----我看问题喜欢从频域而不是空域。这是我成功的主要原因。”因此，如果你想从事一个你喜欢的行业，你的背景绝对不是问题。相反，不能下定决心、有了志向却不努力，才是影响你成功的主因。

Mats在2005年就被诊断患有癌症。但是他天性乐观，对人友善，对科学却有一种执着的追求。2009年在波兰的FOM会议上，Mats做完plenary presentation后，（那个时侯他已经在这个领域赫赫有名了），有一个女士在路上向他问问题。他蹲在路边从行李中拿出一个笔记本，认真地在上面画示意图进行解释。

有一次一个科学编辑问他，是什么力量让他如此痴醉于科研？他说：“想像一下，你所处的世界是一个填字游戏。你站在这个游戏中间。你会开始用想象力去填它，还是会熟视无睹？”他停了一下，又说，“我无法想象让自己停下来不去填。这就是我为什么做科研的原因。”

Mats Gustafsson(1960-2011)。后面的篱笆是否让你联想到了SIM？

让我们纪念Mats，不仅因为他在科研上给我们带来了全新的方法造福人类，而且因为他的谦逊与执着，将照亮我们前行的路。

席鹏课题组文章链接：

我国STED超分辨工作在PLoS ONE发表

OE: 利用共聚焦实现DIC位相浮雕

第八章大结局：阴阳定乾坤

经过前面八章的描述，我想读者已经对超分辨的各种方法有了一定的认识。各种方法和他们的名字，如同八仙过海一般，一个个涌现在我们眼前。

正如牛顿用三定律描述世界，爱因斯坦用相对论描述时空一般，去繁就简，才是大道。

那么，可不可以将这些超分辨技术统一为一种描述？

答案是可以，那就是：阴阳。

《易传·系辞上传》说：“是故，易有太极，是生两仪”。太极即为天地未开、混沌未分的状态。也就是说，所谓的混沌，就是一种不能区分的状态。为了有效地进行区分，才有了阴阳两仪。结合现代技术，阴阳，就是两种状态，也就是我们熟悉的二进制的ON（开）和OFF（关）状态。

反过来看看我们的超分辨技术。STED，通过区分一个点的自发辐射(on)和受激辐射(off)实现超分辨；SSIM，通过调制一系列平行的ON-OFF实现超分辨；PALM/STORM则是随机地调制点的ON-OFF实现超分辨。

再来细看的话，STED和SSIM均是形成一个结构性的光调制来实现超分辨，不依赖于特定的荧光染料。而PALM/STORM则是通过特定染料的性质，通过光控制来实现ON-OFF。

这两类各有优劣：STED需要依赖共聚焦系统，并在其上加一个环形受激辐射光，光路最为复杂，所需要的光功率也非常高，但不需要进行复杂的图像后期处理；SIM则相对来说仪器比较简单（从三个方向上探测莫尔条纹即可），所需功率也较低，但是如果进行SSIM（饱和成像）的话，则功率要求一样很高，且需要进行图像后期频域处理；PALM/STORM则只需要将一个TIRF系统的入射光变为两束，相对的实验门槛低，且所需功率较小（受不同荧光蛋白的开关特性约束）；然而后期图像处理需要逐点进行定位。

也许有人会说，这个领域既然已经如此成功，而且已经总结得如此透彻，是不是没什么新东西可做了？

绝非如此！今年的七月Nature Methods又一次开始重点关注显微领域，包括新的超分辨技术，以及传统显微与生物信息学的结合。